Over de veiligheid van Stevia en stevioside

 

e-mail: Jan.Geuns@bio.kuleuven.ac.be

 

 

Stevia (gedroogde blaadjes) en de eruit geëxtraheerde zoetstof stevioside zijn natuurlijke en aangenaam smakende zoetstoffen. Ondanks de controverse die in België en Europa bestaat omtrent het gebruik van deze zoetmiddelen, worden Stevia en stevioside in verschillende landen reeds gedurende zeer lange tijd gebruikt, o.a. Japan (meer dan 25 jaar), Zuid-Korea, Paraguay, China en ook in de USA worden ze gedoogd als dieetsupplement. Deze tekst is bedoeld om een totaal onschuldig plantje en zoetstof te verdedigen tegen valse profeten die dwalingen verkondigen waardoor ze alleen maar te kennen geven de originele wetenschappelijke literatuur niet bestudeerd te hebben. De fabeltjes die worden verkondigd zijn o.a. dat het gebruik van Stevia of stevioside kankerverwekkend zou kunnen zijn of dat de vruchtbaarheid zou worden aangetast, vooral de mannelijke (hetgeen het grootste psychologisch effect blijkt te hebben). Aan de hand van de wetenschappelijke literatuur zal worden aangetoond dat de onheilsprofeten volledig ongelijk hebben en misschien wel andere belangen dienen!

 

Inleiding: Stevia en stevioside.

 

Stevia rebaudiana Bertoni is een plant behorend tot de familie van de Asteraceae (vroegere Compositae) en komt voor in sommige streken van Z.-Amerika (Paraguay en Brazilië). De plant is van oudsher gekend door de Guarany-indianen die Stevia gebruikten in hun « mate » thee (Ilex paraguariensis). Ook de Spaanse veroveraars uit de zestiende eeuw melden het voorkomen en gebruik van Stevia. Stevia wordt of werd gekweekt in o.a. volgende landen : Paraguay, USA, Mexico, Centraal-Amerika, Japan, China, Rusland, Maleisië, Z.-Korea, Spanje, Italië, UK alsook in België.

 

 

 

	Compound name	R1	R2
1	steviol	H	H
2	steviolbioside	H	bGlc2-1bGlc
3	stevioside	bGlc	bGlc2-1bGlc
4	rebaudioside A	bGlc	bGlc2-1bGlc         3-1bGlc
5	rebaudioside B	H	bGlc2-1bGlc         3-1bGlc
6	rebaudioside C (dulcoside B)	bGlc	bGlc2-1aRha         3-1bGlc
7	rebaudioside D	bGlc2-1bGlc	bGlc2-1bGlc         3-1bGlc
8	rebaudioside E	bGlc2-1bGlc	bGlc2-1bGlc
9	dulcoside A	bGlc	bGlc2-1aRha

 

Fig. 1:     Structuur van stevioside en verwante componenten. In rebaudioside A, B, C, D en E is er een additionele suikereenheid op koolstof 3 van het eerste b-Glucose.

 

De voornaamste zoetstof uit Stevia is stevioside, dat tussen 4 en 20% van het drooggewicht kan uitmaken, in de meeste economische producties rond 11 %. Andere componenten doch in lagere gehalten zijn: dulcoside A (± 0,5 %), steviolbioside (sporen), rebaudioside A (± 3%), B (spoor), C (± 1,5%), D en E (sporen). Chemisch gezien is stevioside een diterpeenglycoside en is 300 x zoeter dan suiker. In vele landen wordt het reeds gebruikt als een veilige calorie-arme zoetstof. Omwille van de bestaande controverse in Europa willen vele mensen meer informatie omtrent Stevia en stevioside. In dit artikel wordt het onderzoek belicht dat gebeurd is om de veiligheid van Stevia aan te tonen.

 

Het metabolisme van stevioside.

 

Componenten gebruikt als of toegevoegd aan voedsel moeten absoluut veilig zijn. Dit impliceert dat niet alleen de toegevoegde stof zelf veilig moet zijn, doch ook zijn mogelijke metabolieten. Daarom moeten al deze verbindingen uitvoerig getest worden in toxicologische studies. In een van dergelijke studies vertoonde steviol, het aglycon van stevioside, een zwakke mutagene activiteit (Pezzuto et al., 1985). Hoewel deze resultaten door andere onderzoekers nooit konden worden bevestigd, en te wijten waren aan een verkeerd proefopzet zoals wij later zullen zien, heeft deze waarneming geleid tot een controverse over de veiligheid van stevia en stevioside.

 

Er werd aangetoond dat stevioside niet wordt opgenomen in ons lichaam en dat de enzymen die tussenkomen bij de spijsvertering van mens en vele dieren, niet in staat zijn om stevioside af te breken tot steviol (Hutapea et al., 1997). Nochtans in voedingsexperimenten met ratten en hamsters werd stevioside wel afgebroken tot steviol door bacteriën van het caecum, een orgaan dat nog zeer actief is bij knaagdieren en hetgeen overeenkomt met onze sterk gedegenereerde blindedarm die weinig functioneel is. Dertig minuten na toedienen van stevioside aan ratten werd steviol in het bloed teruggevonden, met een maximum na 8 uur (Nakayama et al., 1986). Wat is nu het probleem met deze dierproeven? Bij knaagdieren bestaat het verschijnsel van coprofagie, i.e. knaagdieren eten hun eigen uitwerpselen. Waarom doen zij dat? In het caecum van knaagdieren zitten bacteriën die wel b-glycosidische bindingen kunnen afbreken. Zij kunnen nl. cellulose uit hout afbreken tot suikermoleculen, die door de dikke darm niet worden opgenomen. Door hun uitwerpselen op te eten passeren die vrijgezette suikers opnieuw het spijsverteringsstelsel en kunnen nu wel worden opgenomen in het lichaam. In de boven aangehaalde studies met knaagdieren is niet aangegeven dat coprofagie verhinderd werd, zodat dergelijke proeven eigenlijk niets zeggen over wat met stevioside gebeurt bij de mens. Het is wel aangetoond dat geïsoleerde bacteriën uit de dikke darm van de mens stevioside kunnen omzetten met steviol als enige metaboliet (Hutapea et al., 1997), maar of dit in vivo ook gebeurt, is niet geweten. Bovendien is het niet geweten of het eventueel gevormde steviol dan ook in voldoende mate door de dikke darm wordt opgenomen. In alle geval is stevioside gebruikt als zoetstof volkomen veilig gebleken (zie verder). De functie van de dikke darm bestaat voornamelijk uit het recupereren van water en ionen zodat vaste feces ontstaat. In proeven met vetkuikens en legkippen werd aangetoond dat stevioside snel uit de darmen verwijderd wordt, in grote mate onveranderd (Pomaret en Lavieille, 1931; Geuns et al., 2002A). Stevioside of steviol werden niet aangetroffen in het bloed of in de eieren. Bij varkens daarentegen werd alle toegediende stevioside omgezet in steviol. Nochtans werd er geen steviol of stevioside aangetroffen in het bloed (Geuns et al., 2002 B).

 

Mutageniciteitsstudies.

 

Voedingsmiddelen moeten uitvoerig getest worden om er absoluut zeker van te zijn dat ze niet kankerverwekkend zijn. Vermits de studie van kankerverwekkende eigenschappen van componenten in dierproeven jaren duurt en zeer duur uitvalt zeker als vele componenten moeten worden getest, heeft men zogenaamde mutageniciteitstesten uitgewerkt die weinig kosten en zeer snel gaan. In deze testen wordt nagegaan of componenten mutaties of veranderingen in het erfelijk materiaal veroorzaken. Het weze benadrukt dat stoffen die mutaties veroorzaken niet noodzakelijk kankerverwekkend zijn. Componenten die positief scoren in mutageniciteitstesten moeten verder worden onderzocht om na te gaan of ze ook kankerverwekkend zijn, want niet alle mutaties leiden tot kanker. Dit kan op een eenvoudige manier worden aangetoond. Een puntmutatie in het gen dat codeert voor de groeihormoonreceptor bij kippen veroorzaakt dwergmutanten (zgn. bantams). Bij de mens veroorzaakt een dominant gen haargroei op het middenkootje van de ringvinger. Personen met de recessieve mutatie van dit gen die voorkomt bij ¼ van de bevolking, hebben dan geen haartjes, wat helemaal niet wil zeggen dat ze hierdoor kanker zullen krijgen.

 

Mutageniciteitstesten:

 

In de Ames-test wordt gebruik gemaakt van bacteriën die een bepaald aminozuur bv. histidine niet kunnen aanmaken (his-). Deze bacteriën kunnen niet groeien op een medium zonder toegevoegd histidine. Overgeënt op een dergelijk medium zullen de meeste bacteriën afsterven, maar enkele zullen toch kunnen overleven omdat zij zgn. natuurlijke reversiemutanten zijn, i.e.: de originele mutatie wordt bij deze bacteriën terug hersteld, waardoor zij geen toegevoegd histidine nodig hebben. Indien men nu mutagene stoffen toevoegt aan een bacteriecultuur op een histidine-arm medium dan zal het aantal reversiemutanten toenemen. Vermits vele stoffen slechts mutageen zijn na metabolisme in het lichaam, wordt de test ook uitgevoerd na toevoegen van een zgn. metabool activatie-systeem. Dit is een supernatant fractie (S9000g) van levers van dieren die werden blootgesteld aan bekende schadelijke stoffen (bv. polygechloreerde bifenylen (PCB’s) of dioxinen). Deze S9000g fractie zal voor een verder metabolisme zorgen van de componenten die men heeft toegevoegd in de Ames-test.

 

In de geïnduceerde mutatietest worden bacteriën toegevoegd aan een medium dat schadelijke stoffen bevat (bv. 8-azaguanine). De meeste bacteriën zullen afsterven, doch sommige zullen overleven omdat zij door mutatie hun genotype hebben aangepast. In dit testsysteem wordt, in aanwezigheid van de testcomponent, de ontwikkeling gemeten van resistentie boven de normale controle mutatiefrequentie. Dit wordt weerom gedaan met en zonder het zgn. metabool activatiesysteem.

 

In de micronucleus-test wordt bij muizen de testcomponent intraperitoneaal ingespoten. Na 24 - 48 uur worden de muizen gedood en beendermerg wordt microscopisch onderzocht. Aantallen micronucleus polychromatische en micronucleus normochromatische erythrocyten worden geregistreerd t.o.v. het totaal aantal erythrocyten in minstens 1000 erythrocyten per preparaat.

 

In de chromosoom-mutatie test kunnen Chinese hamster long fibroblasten gebruikt worden (CHL). Na 24-48 uur behandeling met de te testen stof in verschillende concentraties in aan- of afwezigheid van het metabool activatiesysteem worden de cellen behandeld met colcemide (demecolcine) (0,2 mg/ml) gedurende 2 uur om de celdelingen stil te leggen. De chromosoom-afwijkingen worden geregistreerd in minstens 100 metafasen van elke behandeling.

 

In de zoogdier cel mutatie test worden CHL cellen gedurende 3 uur in contact gebracht met de te testen stof met en zonder het metabool activatiesyteem. Na 7 dagen cultuur wordt diphtheria toxine toegevoegd en de celkweek duurt nog 7 dagen langer. Dan wordt het aantal diphteria toxine resistente kolonies geteld.

 

In 1985 publiceerden Pezzuto et al. dat stevioside veilig was in mutageniciteitstesten, maar dat metabolisch geactiveerd steviol mutageen was in de geïnduceerde mutatietest. Deze mutageniciteitstesten werden ook uitgevoerd door andere auteurs die echter vonden dat steviol helemaal niet mutageen was in de Ames-test met of zonder metabool activatiesysteem (Procinska et al., 1991; Suttajit et al., 1993; Klongpanichpak et al., 1997). Suttajit et al. (1993) vonden geen mutagene activiteit in de chromosoommutatietest met menselijke lymphocyten en steviol was ook inactief in de micronucleus-test van beenmerg van muizen (Matsui et al., 1996). Procinska et al. (1991) weerlegden de positieve resultaten van geactiveerd steviol bekomen door Pezzuto et al., die de testen uitvoerden met veel te weinig bacteriën, nl. slechts 1 miljoen i.p.v. 100 miljoen bacteriën per schaal zodat de natuurlijke mutaties niet voldoende tot uiting kwamen. Bovendien interpreteerden Pezzuto et al. hun eigen resultaten verkeerd en een herrekening van hun resultaten door Procinska leverde geen enkele aanduiding voor de vroeger beweerde mutagene activiteit op. Klongpanichpak et al. (1997) vonden geen mutagene activiteit van stevioside of steviol in de Ames test uitgevoerd met Salmonella typhimurium TA98 en TA 100 met of zonder het metabool activeringssysteem afgeleid van verschillende diersoorten waaronder ratten, muizen, hamsters en guinese biggetjes. In tegenstelling hiermede vonden Temcharoen et. al. (1998) wel een mutagene activiteit van steviol (90 % zuiver) in een gevoelige Salmonella typhimurium TM677 stam na toevoegen van S9000g fracties van met Aroclor voorbehandelde levers van verschillende diersoorten. De mutagene activiteit nam af van hamster>rat>guinees biggetje>konijn>muis. De mogelijk mutagene metabolieten van steviol zijn nog onbekend. In een andere studie (Terai et al., 2002) vertoonde steviol en 5 van zijn chemisch gesynthetiseerde geoxydeerde derivaten een mutagene activiteit in Salmonella typhimurium TM677. De activiteit van steviol was echter slechts 1/3000 van die van 3,4-benzopyreen. De activiteit van steviol methyl ester 8,13 lacton was slechts 1/24500 van die van furylfuramide. Hoewel een zwakke mutagene activiteit van steviol en van sommige van zijn derivaten werd gevonden in de zeer gevoelige Salmonella typhimurium TM677 stam, besluiten de auteurs toch dat het dagelijks gebruik van stevioside als zoetstof volkomen veilig is. Bovendien werd de aanwezigheid van de chemisch gesynthetiseerde steviolderivaten nog nooit aangetoond in het bloed van proefdieren die werden gevoederd met stevioside. Zeer hoge doses steviol (90 % zuiverheid) geïntubeerd bij hamsters (4g/kg lichaamsgewicht) of bij ratten en muizen (8g/kg) induceerden geen micronucleï in beenmerg erythrocyten van zowel mannelijke als vrouwelijke proefdieren. Nochtans veroorzaakten deze zeer hoge concentraties lichte cytotoxische effecten bij de vrouwtjes, doch niet bij de mannetjesdieren van alle onderzochte species (Temcharoen et al., 2000).

Andere uitgevoerde testen waren niet volgens de voorschriften of gebeurden in hamster long fibroblasten, terwijl het bekend is dat hamsters een totaal ander metabolisme van stevioside hebben dan ratten en de mens. De relevantie van testen met hamsters kan in vraag gesteld worden.

 

In 1991 toonden Pezzuto et al. aan dat steviol helemaal niet bindt aan DNA, volgens de auteurs een absolute vereiste om ook maar enige mutagene activiteit te bezitten. Het zou anderzijds ook zeer verwonderlijk zijn dat steviol mutagene activiteit zou bezitten, terwijl het slechts van ent-kaurenaat verschilt door een hydroxyl die ingeplant zit op koolstof C-13 en dat zelf niet mutageen is. Alle planten bevatten dit ent-kaurenaat en andere verwante componenten zoals de gibberellinen, een groep van natuurlijke plantenhormonen die niet mutageen zijn en van dewelke vele ook een 13 hydroxylfunctie bezitten. Bovendien worden deze stoffen dagelijks door de hele wereldpopulatie geconsumeerd vermits ze in alle groenten aanwezig zijn.

 

Naast mutageniciteitstesten werden er ook talrijke studies verricht waarin men rechtstreeks de kankerverwekkende eigenschappen bestudeerde van Stevia, stevioside en/of steviol.

 

Yamada et al. (1985) dienden dagelijks aan zowel mannelijke als vrouwelijke F344 ratten voer toe met verschillende concentraties stevioside (0 tot maximaal 1 %) en dit gedurende 22 (mannelijke) of 24 (vrouwelijke) maanden. Na deze proefperiode werden de dieren gedood en werden er uitvoerige biochemische, anatomische, pathologische en carcinogene testen gedaan. Nooit werden er ook maar enige aanduidingen van carcinogene activiteit gevonden, zelfs niet bij de hoogste concentratie (1%) hetgeen minstens 125 x de dagelijkse dosis is nodig om alle ingenomen voedingswaren te zoeten.

 

Xili et al. (1992) bestudeerden de effecten van chronisch toedienen van stevioside in verschillende concentraties gedurende 24 maanden bij ratten (tot maximum 1,2 %). Geen enkel effect kon worden vastgesteld van het toedienen van stevioside, ook geen verhoogde gevallen van kankers, zelfs niet bij de hoogste concentratie van 1,2 %. Hieruit leidden de onderzoekers een ADI (allowable daily intake, zie later) af voor stevioside van 7,938 mg/kg lichaamsgewicht bij mensen (veiligheidsfactor = 100). Dit is in feite een minimale schatting van de ADI, vermits geen hogere concentraties getest werden.

 

In 1997 publiceerden Toyoda et al. een chronische studie met F344 ratten die stevioside kregen toegediend. Zij vonden geen enkele aanduiding van verhoogde kankers of andere problemen. Nochtans kregen de ratten zeer hoge concentraties stevioside, nl. 2,5 tot 5 %, i.e. een dagelijkse dosis van 385 of 775 mg per rat oftewel dagelijks 1 of 2 g stevioside per kg lichaamsgewicht! Bij mannelijke ratten had het aantal testis-kankers de neiging te dalen en bij vrouwelijke ratten was het aantal borstkankers significant afgenomen.

 

Ook de JECFA kwam tot de conclusie dat stevioside geen enkele carcinogene activiteit vertoont (WHO, 1999).

 

Hagiwara et al. (1984) vonden in een studie met ratten geen enkele aanduiding dat stevioside blaaskanker zou verhogen.

 

Naast al de wetenschappelijke studies die bewijzen dat stevioside volledig veilig is, zijn er nooit rapporten verschenen die aantonen dat het gebruik van Stevia of stevioside het aantal kankergevallen verhoogt, zelfs niet na een langdurig gebruik ervan (Paraguay: meer dan 500 jaar, Japan: meer dan 25 jaar, Z.-Korea: 16 jaar, Brazilië: 13 jaar, China: 12 jaar, USA: sinds 1995 gedoogd als dieetsupplement). Het besluit kan zeker zijn dat Stevia en stevioside volledig veilig zijn op gebied van carcinogene activiteit.

 

Acute toxiciteit.

 

De dood is een onbetwistbaar criterium. In acute toxiciteitstesten wordt de dosis bepaald waarbij de helft van de proefdieren sterft (zgn. LD50 of lethal dose 50%).

 

Stevioside en steviol hebben een zeer lage acute orale toxiciteit bij muizen, ratten en hamsters, hetgeen betekent dat de waarde van de LD50 groot is (Medon et al., 1982; Toskulkao, 1997). Stevioside in een dosis van 15 g/kg lichaamsgewicht was niet lethaal voor muizen, ratten of hamsters. Hamsters bleken wel gevoeliger voor steviol, het aglycon van stevioside, dan ratten of muizen. De LD50 voor steviol in hamsters was 5,2 g en 6,1 g/kg voor respectievelijk mannetjes of vrouwtjes. Bij ratten en muizen was de LD50 voor steviol hoger dan 15 g/kg lichaamsgewicht bij zowel mannetjes als vrouwtjes (Toskulkao, 1997).

Een orale LD50 van 17 g/kg werd gevonden voor Stevia extract (20% stevioside) en 15 g/kg voor gezuiverd stevioside (93.5 %). Mitsuhashi (1976) vond een LD50 van 8,2 g/kg voor ratten en muizen bij orale inname, en van 2,99 g/kg bij intraperitoneale injectie, doch dit laatste heeft niets met het gebruik als voedingsstof te maken.

Gezien stevioside 300 maal zoeter is dan suiker, komt een LD50 van 8,2 g/kg lichaamsgewicht overeen met een zoetkracht van 2,5 kg sucrose/kg lichaamsgewicht!

 

 

Subacute (chronische) toxiciteit.

 

In subacute toxiciteitstesten worden lagere concentraties getest over langere tijdsperioden om de zgn. NOEL (no observable effect level) te bepalen, i.e. de maximumconcentratie waarbij geen enkel effect van de toegediende stof kan gemeten worden. Deze NOEL is belangrijk om de ADI te bepalen (Acceptable Daily Intake, zie tabel 1). De ADI wordt bekomen door de NOEL te delen door 100 (dit is het product van een factor 10 om van proefdieren over te gaan naar de mens, en nog eens een veiligheidsfactor 10).

 

Subacute toxiciteitsstudies werden uitgevoerd met zuiver stevioside dagelijks toegediend aan rattenvoer in concentraties tot 7% gedurende 3 maanden (Akashi and Yokoma, 1975). In andere studies kregen ratten dagelijks 2,5 g zuiver stevioside per kg en dit gedurende 3 maanden (Mitsuhashi, 1976). In beide studies werden geen effecten gevonden van toegediend stevioside. Dit betekent dat de NOEL minstens 2,5 g/kg/dag is en dat de ADI gelijk is aan minstens 25mg/kg lichaamsgewicht.

 

Aze et al. (1991) voerden aan F344 ratten stevioside in doses van 0,625, 1,25 en 2,5 g/kg gedurende 13 weken. De auteurs concludeerden dat er geen enkel significant effect was van het toegediende stevioside en beschouwden 2,5 g/kg als een acceptabele NOEL. Hieruit volgt een ADI van 25 mg/kg.

 

Zowel mannelijke als vrouwelijke hamsters werden dagelijks geforceerd gevoed met verschillende hoeveelheden stevioside (0, 0,5, 1 en 2,5 g/kg lichaamsgewicht). Dit experiment verliep over verschillende generaties (Yodyingyuad en Bunyawong, 1991). De auteurs besloten dat stevioside, zelfs in de hoogste dosis van 2,5 g/kg lichaamsgewicht, geen effect had op de groei of de voortplanting van de hamsters. Hieruit volgt weerom een ADI van 25 mg/kg.

 

ADI (mg/kg body weight/day)	Animal	NOEL g/kg bw/d	Reference
7.938* 25 25 25 25 (stevioside) 21 (mannetjes) 24 (vrouwtjes) 6.25**(steviol)	Wistar rat rat rat rat F344 hamster Wistar rat Wistar rat hamster	0,794* 2,5 2,5 2,5 2,5 2,1 2,4 0,25**	Xili et al., 1992 Akashi and Yokoyama, 1975 Mitsuhasi, 1976 Aze et al., 1991 Yodyingyuad and Bunyawong, 1991 Mori et al., 1981 Mori et al., 1981 Wasuntarawat et al., 1998

 

  Tabel 1 : Overzicht van ADI’s voor stevioside berekend uit gepubliceerde NOEL’s

 

* De ADI berekend door Xili et al. (1992) is een minimum waarde gezien de auteurs geen hogere concentraties getest hebben.

** Deze ADI werd berekend uitgaande van de NOEL voor steviol (250 mg/kg lichaamsgewicht/dag) onder zeer ongunstige omstandigheden vermits steviol gemakkelijk wordt opgenomen door de darmen van de hamster en wordt gemetaboliseerd tot verschillende onbekende componenten, terwijl dit niet het geval is voor stevioside. Bovendien is het bekend dat hamsters zeer gevoelig zijn voor toegediende steviol en een ander metabolisme hebben dan ratten en de mens.

 

 

Effecten op vruchtbaarheid en vruchtafdrijvende eigenschappen.

 

Planas en Kuć publiceerden in 1968 dat een water-afkooksel van Stevia bladeren werd gebruikt door Paraguyaanse Matto Grosso Indianen als voorbehoedsmiddel, en dat deze afkooksels in hun experimenten tevens de vruchtbaarheid van vrouwelijke ratten verminderde. Deze beweringen konden nooit worden gestaafd door de vele onderzoekers die sindsdien proeven op vruchtbaarheid hebben uitgevoerd. Bovendien werden in een uitgebreide veldstudie nooit indianenstammen gevonden die dit middel als voorbehoedsmiddel gebruikten of er zelfs maar van gehoord hadden (Soejarto et al., 1983). In 1996 heeft Shiotsu zo getrouw mogelijk het werk van Planas en Kuć overgedaan, maar dan met veel grotere aantallen proefdieren en met nog hogere concentraties. Zij vonden geen enkel nadelig effect van Stevia extract op vruchtbaarheid of overleving van de nakomelingschap.

 

Akashi en Yokoyama (1975) testten hoge doses Stevia extract (equivalent met 525 mg stevioside /kg/dag) bij mannelijke en vrouwelijke muizen gedurende de copulatie en zwangerschap. Er werd geen enkel verschil gevonden in copulatie of bevruchting en er werden geen verschillen gevonden in de groei en conditie van de foetussen of van hun nakomelingschap.

 

Mori et al. (1981) dienden stevioside toe aan het voer van mannelijke en vrouwelijke Wistar ratten voor en bij de start van de zwangerschap (0,15 %, 0,75 % en 3 % stevioside). De consumptie van stevioside in de 3 behandelde groepen was 100, 480 en 2100 mg/kg/dag voor mannelijke, en 120, 530 en 2400 mg/kg/dag voor vrouwelijke ratten. Mannetjes ontvingen stevioside vanaf 60 dagen voor het paren en vrouwtjes vanaf 14 dagen ervoor tot dag 7 van de zwangerschap. Er werden helemaal geen verschillen gevonden tussen de verschillende groepen in sexuele cyclus, in paargedrag, vruchtbaarheid, zwangerschap. Er waren ook geen abnormaliteiten voor wat betreft inplanting van de bevruchte eicel of de overleving van de foetus. De groei, algemeen uitzicht, ingewanden en skelet van de foetussen waren gelijk. Het uiteindelijk lichaamsgewicht van de verschillende groepen was gelijk, hoewel in het begin er een iets lager lichaamsgewicht werd gevonden bij de ouderdieren en dit bij de hoogste concentratie (3%) zowel bij mannetjes als bij vrouwtjes. Dit is mogelijk te wijten aan het feit dat veel te zoet voer niet als lekker werd ervaren en dat er een zekere aanpassingsperiode was. De auteurs besluiten dat er geen enkel effect is, zelfs niet bij de hoogste concentratie, op paargedrag, vruchtbaarheid of ontwikkeling van de foetussen.

 

Ook geconcentreerde bladextracten van Stevia (0,667 g gedroogde bladeren/ml, 2 ml/rat tweemaal per dag) bleken geen invloed te hebben op de mannelijke vruchtbaarheid noch op de groei van jonge mannelijke ratten (Oliveira-Filho et al., 1989).

 

Sinchomi en Marcorities (1989) bestudeerden de effecten van gedurende 31 dagen toegediende Stevia extracten bij mannelijke Wistar ratten die 270 g wogen bij het begin van het experiment. De hoeveelheden dagelijks toegediend stevioside waren 0, 13, 65 en 260 mg/kg. Er werden geen effecten waargenomen op het gewicht van de dieren noch op het gewicht van de mannelijke organen (zaadblaasjes, prostaat, hypophyse, testes). Er was geen atrofie van de zaadleiders en zaadproductie was in alle behandelingen normaal.

 

Eén maand oude mannelijke en vrouwelijke hamsters werden bijgevoed met stevioside (0, 0,5, 1 en 2,5 g/kg/dag) gedurende 22 (mannelijke) of 24 maanden (vrouwelijke). Er werden nooit verschillen in groei of fertiliteit gevonden. Gedurende de periode van het experiment kreeg elk vrouwtje 3 maal een nakomelingschap. De duur van de zwangerschap, het aantal foetussen, het aantal jongen waren telkens gelijk tussen de verschillende groepen. De jonge hamsters die altijd stevioside kregen toegediend via het drinkwater en vanaf 1 maand ouderdom via intubering zoals hun ouders, vertoonden een normale groei en fertiliteit. Geen enkel effect werd waargenomen op groei of reproductie.

 

Vermits embryo’s zeer gevoelig reageren op toxische stoffen, werden bevruchte eieren op dag 7 van de incubatie geïnjecteerd met verschillende hoeveelheden stevioside (0.08, 0.8 en 4 mg per ei) of steviol (0.025, 0.25 en 1.25 mg per ei). Bij het uitkippen en 1 week later kon geen enkel effect gevonden worden op embryonale mortaliteit, gewicht of deformaties van de kuikens. Ook de gonaden ontwikkelden normaal (Geuns et al., 2002C).

 

Toxiciteit voor voortplantingsorganen.

 

Yamada et al. (1985) vonden geen enkel effect op spermatogenese, noch op interstitiële celproliferatie noch op tumorvorming in de testes.

 

Oliveira-Filho et al. (1989) voerden 25-30 dagen oude mannelijke ratten gedurende 60 dagen een zeer hoge concentratie Stevia extract. Elke rat ontving het equivalent van 2,668 g droge blaadjes per dag, i.e. 5,34 % van hun lichaamsgewicht, en omgerekend volgens het versgewicht van de blaadjes is dit ongeveer 50% van hun lichaamsgewicht. Dit is een zeer grote hoeveelheid: 53.4 g droge Stevia blaadjes/kg lichaamsgewicht bij het begin van het experiment (ratten wogen 50 g) en ongeveer 13,75 g/kg op het einde (ratten wogen dan 194 g). Indien we een stevioside-gehalte van 10% veronderstellen wil dat zeggen dat de jonge dieren 5,3 g stevioside/kg lichaamsgewicht ontvingen en de oudere dieren nog 1,37 g/kg. Hoewel de auteurs een afgenomen gewicht van de zaadblaasjes (± 60%) vonden, besloten ze toch dat de mannelijke vruchtbaarheid zeker niet beïnvloed werd. Spijtig genoeg werd enkel 1 zeer hoge concentratie getest en werden er geen dosis-effect studies ondernomen. Melis (1999) deed gelijkaardige proeven met jonge ratten en bereidde Stevia extracten van dezelfde concentratie als Oliveira-Filho et al. (1989). Hij voedde de jonge mannelijke ratten gedurende 60 dagen en vond een gereduceerd gewicht van testes, van zaadblaasjes en de cauda epididymidis. Hij vond tevens een verlaging van de sperma-concentratie evenals van het testosterone-gehalte, mogelijk te wijten aan een veronderstelde affiniteit van glycosiden van het extract voor een androgeen receptor. Melis suggereert de mogelijkheid van een verlaagde vruchtbaarheid van mannelijke ratten. Deze resultaten steken schril af tegen die van Oliveira-Filho (1989) die extracten van dezelfde concentratie gebruikte. Het verschil tussen beide extracten was echter dat Melis de waterextracten volledig droogdampte, waarbij de mogelijkheid bestaat dat er verschillende chemische modificaties van componenten andere dan stevioside in het extract optreden. Het is aangetoond dat stevioside zelf zeer stabiel is. De waargenomen effecten zijn mogelijk te wijten aan de ontstane artefacten in het extract en niet aan stevioside zelf! Het is ook op te merken dat de gebruikte extract-concentratie zeer hoog is: bij de start van het experiment 5,34 % van het lichaamsgewicht of rond 5,3 g stevioside/kg. Voor een volwassen persoon van 65 kg betekent dit een extract van 3,47 kg droge Stevia-blaadjes, of van ongeveer 34,7 kg verse blaadjes per dag, oftewel meer dan 50 % van het lichaamsgewicht! De betekenis van dergelijke proeven waar slechts 1 uitzonderlijk hoge concentratie getest wordt, zou in vraag moeten gesteld worden. In alle geval zijn Melis’ resultaten in tegenspraak met alle hoger aangehaalde en hierna volgende studies die geen enkel effect op vruchtbaarheid van mannelijke of vrouwelijke dieren konden vinden. Ook in populaties die sinds geruime tijd Stevia en stevioside als zoetstof gebruiken, werden geen negatieve effecten op vruchtbaarheid gemeld (Japan, China, Paraguay, Z.-Korea, USA).

 

Samenvattend kan gesteld worden dat toegediend stevioside geen enkel effect heeft op vruchtbaarheid, paargedrag, zwangerschap, aantal foetussen, noch op de groei of vruchtbaarheid van de nakomelingschap (Yodyingyuad en Bunyawong, 1991; Mori et al., 1981; Oliveira-Filho et al., 1989; Sinchomi en Marcorities, 1989; Usami et al., 1995; Shiotsu, 1996; Geuns et al., 2002C). Nochtans, indien men steviol (het aglycon van stevioside) geeft aan hamsters tussen dagen 6 en 10 van de zwangerschap en in hoge doses van 500 tot 1000 mg/kg lichaamsgewicht, bekomt men toxische effecten (Wasuntarawat et al., 1998). Het aantal levende foetussen per worp nam af alsook het gemiddelde foetusgewicht. In de nieren van de moederdieren was er een dosis-afhankelijke toename in kronkelende nierbuisjes. Ondanks de waargenomen effecten bij hoge concentraties was de NOEL toch nog 250 mg steviol/kg lichaamsgewicht, hetgeen overeenkomt met 625 mg stevioside/kg lichaamsgewicht.

 

Deze laatste studie met steviol heeft eigenlijk niets te maken met het gebruik van stevioside als zoetstof. Indien men hamsters voedert met stevioside worden er immers geen toxische effecten waargenomen, zelfs niet in 3 opeenvolgende generaties (Yodyingyuad en Bunyawong, 1991). Het probleem met steviol toegediend in het voer is dat het rechtstreeks kan worden opgenomen door de darmen, terwijl stevioside niet wordt opgenomen. Stevioside wordt slechts afgebroken door de bacteriën van het caecum of het colon waaruit steviol mogelijks kan worden geresorbeerd, of terug opgenomen worden uit de feces via coprofagie. Bovendien blijken hamsters zeer gevoelig te zijn voor steviol (Toskulkao et al., 1997), de reden waarom ze in deze studie werden genomen. De NOEL voor steviol was 250 mg/kg lichaamsgewicht, hetgeen overeenkomt met 625 mg stevioside/kg. Zelfs onder deze zeer ongunstige omstandigheden kan toch nog een ADI van 2,5 mg steviol/kg bekomen worden, hetgeen overeenkomt met 6,25 mg stevioside/kg lichaamsgewicht, hetgeen kort is bij de (onderschatte) 7,9 mg/kg bekomen door Xili et al. (1992, zie ook tabel 1).

 

Naast het gebrek aan effecten van Stevia-extracten of stevioside in dierproeven over vruchtbaarheid zijn er geen negatieve rapporten bekend over de invloed op de menselijke vruchtbaarheid sinds het massale gebruik van Stevia en stevioside in Japan (sinds meer dan 25 jaar), in de USA (sinds 1995) of in andere landen.

 

 

Bio-beschikbaarheid van nutriënten uit het dieet.

 

 

Sommige componenten toegevoegd aan het voedsel kunnen eventueel de opname van andere essentiële elementen negatief beïnvloeden. Op die wijze worden groeicurven beïnvloed of kunnen andere nadelige fysiologische effecten optreden. Als voorbeeld kunnen we plantaardige oliën nemen die zeer veel vetoplosbare vitaminen bevatten. Vervanging van deze natuurlijke oliën door synthetische vetten waarin geen vitaminen zitten, kan de opname van andere vetten beïnvloeden en kan leiden tot een veelheid van fysiologische verstoringen te wijten aan het gebrek aan essentiële lipiden en vitaminen.

 

Stevia en stevioside hebben geen negatieve gevolgen voor de bio-beschikbaarheid van andere voedingsstoffen uit het dieet en ze veroorzaken geen nadelige fysiologische gevolgen. Dit kan worden afgeleid van de gegevens gebruikt voor het bepalen van de ADI (zie boven) alsook van het gebruik van Stevia en stevioside in landen zoals Paraguay, Brazilië, China, Japan en de USA.

 

Studies waarin men Stevia-extract of stevioside-oplossingen inspuit in de proefdieren, of waarin men gebruik maakt van perfusie-experimenten van organen zijn natuurlijk niet relevant voor het gebruik van Stevia als zoetstof. Zoals hoger reeds aangegeven wordt de zoetstof uit Stevia gebruikt in lage concentraties om te zoeten niet opgenomen in het menselijk lichaam en niet gemetaboliseerd door zijn verteringsenzymen.

 

Uit eigen proeven op de groei van vetkuikens gedaan in samenwerking met het laboratorium voor fysiologie en immunologie van huisdieren (KULeuven) blijkt dat chronische toediening van stevioside geen enkel effect heeft op de groei en ontwikkeling van deze dieren. Vetkuikens zijn bijzonder interessant in dit opzicht omdat zij op 6 weken tijd met een factor 50 x in gewicht toenemen. De geringste verstoring van de opname van noodzakelijke elementen uit de voeding is zichbaar als een verminderde groei (Geuns et al., 2002 A).

 

Uit het werk over subacute toxiciteit en de bepaling van de ADI komt duidelijk naar voor dat Stevia noch stevioside enig effect hebben op de bio-beschikbaarheid van andere noodzakelijke elementen, vermits er nooit effecten op groei of gewicht konden worden waargenomen, noch op andere fysiologische processen (zie hoger).

 

Ook in de landen waar Stevia en stevioside overvloedig gebruikt worden, zijn er geen nadelige gevolgen gevonden op groei en ontwikkeling of op andere fysiologische functies van het menselijk lichaam.

 

 

Stevia, stevioside en speciale groepen in de bevolking.

 

Stevia en stevioside zijn absoluut veilig voor diabetici. Het weglaten van de overdadig veel toegevoegde suiker in de voeding is gezond voor diabetici alsook voor alle andere mensen (Boeck-Haebisch, 1992).

Stevia en stevioside zijn ook absoluut veilig voor fenylketonurie-patiënten vermits er geen aromatische aminozuren bij de zoetstof betrokken zijn.

Zwaarlijvige personen kunnen gewicht verliezen als de toegevoegde suiker in de voeding wegvalt door het gebruik van Stevia en stevioside. De aandachtige lezer kan zich de vraag stellen waarom er in dierproeven geen gewichtsverlies wordt gevonden door het toevoegen van Stevia of stevioside als zoetmiddel. Het antwoord is zeer eenvoudig: aan de meeste dierenvoeding wordt er niet overdadig veel suiker toegevoegd zoals bij mensenvoeding wel het geval is. Hierdoor komen Stevia of stevioside niet in de plaats van de toegevoegde suiker. Vermits het calorie-arme zoetstoffen zijn, hebben ze geen effect.

 

Het weglaten van de toegevoegde suiker in het voedsel verhoogt de relatieve verhouding van polymere koolhydraten hetgeen gunstig is voor een gebalanceerde voedselinname (Anonymous, 1996). De in voeding toegevoegde suiker is absoluut overbodig en wordt niet nuttig gebruikt. Wij worden verondersteld elke dag groenten te eten en daarin zitten voldoende suikers om aan onze normale behoeften te voldoen. Extreme sportprestaties worden hier buiten beschouwing gelaten.

 

Natuurlijk geldt voor alle bevolkingsgroepen dat naast teveel suiker, ook teveel vet moet vermeden worden.

 

Stevia en allergeniciteit?

 

In de wetenschappelijke literatuur kunnen geen gegevens gevonden worden als zou Stevia of stevioside allergene eigenschappen bezitten (Suttajit et al., 1993; + hoger geciteerde referenties). Ook Kinghorn (1992) kwam tot dezelfde conclusie: er werden geen publicaties gevonden die suggereren dat Stevia blaadjes immunologisch actief zijn als ze worden ingenomen. Ook is er geen enkele evidentie dat stevioside allergische contact dermatitis veroorzaakt. Er is wel een melding dat sommige mensen allergisch kunnen zijn aan pollenkorrels van Stevia.

 

Stevioside en caries.

 

Stevioside en rebausioside A werden getest op cariogeniciteit in albino Sprague-Dawley ratten (Das et al., 1992). Er werden geen effecten op caries-vorming waargenomen. Hoewel in andere experimenten is aangetoond dat geconcentreerde Stevia-extracten of hoge concentraties stevioside de groei van sommige bacteriën kunnen afremmen, wil dat niet zeggen dat wij daar enige baat bij hebben! Stevia of stevioside als zoetstof gebruikt worden slechts in zeer lage concentraties aangewend, waarschijnlijk veel te laag om ook maar enig effect te kunnen hebben. Het voordeel van het gebruik van stevioside is wel onrechtstreeks door het vervangen van de toegevoegde suiker in de voeding door een niet-cariogene zoetstof.

 

Zuiverheid van stevioside.

 

De zuiverheid van stevioside in de verschillende experimenten is niet altijd dezelfde. Nochtans in de meeste proeven is de zuiverheid van stevioside boven de 90 % en dikwijls boven 95 %. De onzuiverheden in de stevioside-stalen zijn te wijten aan stoffen die mee geëxtraheerd werden uit de Stevia-blaadjes (o.a. rebaudioside A) die zelf ook volledig veilig zijn. Daarom is het probleem van de zuiverheid van stevioside misschien eerder een kwestie van academisch dispuut dan een kwestie van bezorgdheid over de menselijke gezondheid. Stevioside is veilig evenals Stevia blaadjes en ruwe extracten ervan. Daarom zal het voorkomen van een klein percentage (5 – 10 %) overblijvend bladextract in de stevioside-bereiding geen enkele invloed hebben op de menselijke gezondheid, en zal de berekende NOEL of ADI slechts een kleine afwijking vertonen van enkele procenten.

 

Voor verdere details over de veiligheid van Stevia en stevioside wordt verwezen naar een overzichtsartikel (Geuns, 2000).

 

 

Literatuur.

 

• Akashi H. and Yokoyama Y. (1975) Security of dried-Leaf Extracts of Stevia. Toxicological Tests. Food Industry 18, 34-43.

 

• Anonymous: Voedingsaanbevelingen voor België, (D/1996/7795/12) Ed. G. De Backer, Zevecotestraat 43, B-9830 Sint-Martens-Latem, pp 77.

 

• Aze, Y., K. Toyoda, K. Imaida, S. Hayashi, T. Imazawa, Y. Hayashi and M. Takahashi (1991): Subchronic oral toxicity study of stevioside in F344 rats; Bulletin of National Institute of Hygenic Science 109, 48-54.

 

• Boeckh-Haebisch E.M.A. (1992): Pharmacological Trial of a concentrated crude extract of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni in healthy volunteers; Arq. Biol. Tecnol. 35(2), 299-314.

 

• Das S., A.K. Das, R.A. Murphy, I.C. Punwani, M.P. Nasution and A.D. Kinghorn (1992): Evaluation of the Cariogenic Potential of the Intense Natural Sweeteners Stevioside and Rebaudioside A. Caries Res. 26, 363-366.

 

• Farnsworth, N.R. (1973) Current status of sugar substitutes. Cosmet. Perfum. 88, 27-35.

 

• Geuns J.M.C.: Safety of Stevia and stevioside. Recent Res. Devel. Phytochem. 4, 75-88 (2000).ISBN: 81-7736-026-0

 

·         Geuns J.M.C., Malheiros R.D., Moraes V.M.B., Decuypere E. M.-P., Compernolle F., Buyse J.G. (2002A) Most of the administered stevioside is not metabolised by chickens. J. Agr. Food Chem. (submitted).

 

·         Geuns J.M.C., Driessen B., Geers R. and Buyse J.G. (2002B) Metabolism of stevioside in pigs. J. Science of Food and Agriculture (submitted).

 

• Geuns J. M.C., Bruggeman V., Buyse J.G. (2002C) Effect of stevioside and steviol on the developing broiler embryo’s. J. Science of Food and Agriculture (submitted).

 

• Hagiwara A., S. Fukushima and M. Kitaori (1984) Effects of the three sweeteners on rats urinary bladder carcinogenesis initiated by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann 75, 763-768.

 

• Hutapea A.M., Ch. Toskulkao, D. Buddhasukh, P. Wilairat and Th. Glinsukon (1997) Digestion of Stevioside, a Natural Sweetener, by Various Digestive Enzymes. J. Clin. Biochem. Nutr. 23, 177-186.

 

• Kinghorn A.D. (1992): Food Ingredient Safety Review: Stevia rebaudiana leaves. Herb Research Foundation, USA.

 

• Klongpanichpak S., C. Toskulkao, P. Temcharoen, S. Apibal, T. Glinsukon (1997): Lack of Mutagenicity of Stevioside and Steviol in Salmonella typhimurium TA 98 and TA100. J. Med. Assoc. Thailand 80, 121-128.

 

• Matsui M., Matsui K., Kawasaki Y., Oda Y., Noguchi T., Kitagawa Y., Sawada M., Hayashi M., Nohmi T., Yoshihira K., Ishidate M. and Sofuni T. (1996) Evaluation of the Genotoxicity of Stevioside and Steviol using six in vitro and one in vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 11(6), 573-579.

 

• Matsui M., T. Sofuni and T. Nohmi (1996b): Regionally-targeted mutagenesis by metabolically-activated steviol: DNA sequence analysis of steviol-induced mutants of guanine phosphoribosyltransferase (gpt) gene of Salmonella typhimurium TM677.

 

• Medon P.J., J.M. Pezzuto, J.M. Hovanec-Brown, N.P. Nanayakkara, D.D. Soejarto, S.K. Kamath and A.D. Kinghorn (1982): Safety assesment of some Stevia rebaudiana sweet principles. Fed. Proc. 41, 1568-1982.

 

• Melis M.S. (1996) A crude Extract of Stevia rebaudiana increases the Renal Plasma Flow of Normal and Hypertensive Rats. Brazilian J. Medical and Biological Research 29 (5), 669-675.

 

• Melis M.S. (1999): Effects of chronic administration of Stevia rebaudiana on fertility in rats. J. Ethnopharmacology 167, 157-161.

 

• Mitsuhashi H. (1976) Safety of stevioside. In Tama Biochemical Co. Ltd. Report on Safety of Stevia. pp. 1-20 (1981).

 

• Mori N., M. Sakanoue, M. Takcuchi, K. Shimpo and T. Tanabe (1981) Effect of Stevioside on fertility in rats. Shokuhin Eiseiga Ku Zasshi (J. Food Hyg. Soc. Jpn) 22, 409-414.

 

• Nakayama K., D. Kasahara and F. Yamamoto (1986) Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion of Stevioside in Rats. J. Food Hygienic Society of Japan 27, 1-8.

 

• Oliveira-Filho R.M., O.A. Uehara, C.A.S.A. Minett and L.B.S. Valle: Chronic Administration of Aqueous Extract of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni in Rats: Endocrine Effects. Gen. Pharmac. 20(2), 187-191 (1989).

 

• Pezzuto J.M., C.M. Compadre, S.M. Swanson, N.P. D. Nanayakkara and A.D. Kinghorn (1985): Metabolically activated steviol, the aglycone of stevioside, is mutagenic. Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 82, 2478 - 2482.

 

• Pezzutto, J., Che C.-T., McPherson, D.D., Zhu, H.-P., Topgu, G., Erdelmeier, C.A.J., and Gordell, G.A. et al. (1991): DNA as an affinity probe useful in the detection and isolation of biologically active natural products. Journal of Natural Products 54, 1522-1530.

 

• Planas, G. M. and J. Kuc: Contraceptive properties of Stevia rebaudiana Science 162 (1968) p. 1007

 

• Pomaret M. and R. Lavieille (1931): Le principe à saveur sucrée du Kaà-hè-é (Stevia rebaudiana Bertoni). Quelques propriétés physiologiques du Stévioside. Bulletin de la Société de Chimie biologique, 13, 1248-1252.

 

• Procinska E., B.A. Bridges and J.R. Hanson (1991): Interpretation of results with 8-azaguanine resistance system in Salmonella typhimurium: no evidence for direct acting mutagenesis by 15-oxosteviol, a possible metabolite of steviol. Mutagenesis 6 (2), 165-167.

 

• Shiotsu S. (1996) Fertility study of Stevia decoction in rats. Technical Journal on Food and Chemicals, 4, 108-113.

 

• Sinchomi D. and P. Marcorities (1989): Etude de l'activité anti-androgénique d'un extrait de Stevia rebaudiana Bertoni. Plantes médicinales et phtythérapie, 23 (4), 282-287.

 

• Soejarto, D.D., Compadre, C.M., Medon,P.J., Kamath, S.K., and Kinghorn, A.D. (1983): Potential Sweetening Agents of Plant Origin, II. Field Search for Sweet-Tasting Stevia Species; Economic Botany 37, 71-79.

 

• Suttajit M., U. Vinitketkaumnuen, U. Meevatee and D. Buddhasukh (1993): Mutagenicity and Human Chromosomal Effect of Stevioside, a Sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni. Environmental Health Perspectives Supplements, 101, 53-56.

 

·         Temcharoen, P.; Pimbua, J.; Glinsukon, T.; Rojanapo, W.; Apibal, S. Mutagenic activity of steviol to Salmonella typhimurium TM 677 : Comparison of the activity of S9 liver fractions from five laboratory animal species. Bull. Health Sci. & Tech. 1998, 1, 38-45.

 

·         Temcharoen P, Klongpanichpak S, Glinsukon T, Suwannatrai M, Apibal S and Toskulkao C, Evaluation of the effect of steviol on chromosomal damage using micronucleus test in three laboratory animals species. J Med Assoc Thai 83, 101-107 (2000).

 

• Terai T., Ren H., Mori G., Yamaguchi Y. and Hayashi T. (2002) Mutagenicity of Steviol and its oxidative derivatives in Salmonella typhimurium TM677. Chem. Pharm. Bull. 50 (7), 1007-1010.

 

• Toskulkao C., Deechakawan W., Leardkamolkarn V., Glinsukon T. and Buddhasukh D. (1994) The low calorie natural sweetener stevioside: nephrotoxicity and its relationship to urinary enzyme excretion in the rat. Phytotherapy Research 8(5), 281-286.

 

• Toskulkao C, L. Chaturat, P. Temcharoen and T. Glinsukon (1997): Acute toxicity of stevioside, a natural sweetener, and its metabolite, steviol, in several animal species. Drug and Chemical Toxicology 20, 31-44.

 

• Toyoda, K., H. Matsui, T. Shoda, C. Uneyama, K. Takada and M. Takahashi (1997): Assessment of the Carcinogenicity of Stevioside in F344 Rats; Food and Chemical Toxicology 35, 597-603.

 

• Usami M., K. Sakemi, K. Kawashima, M. Tsuda and Y. Ohno (1995): Teratogenicity study of stevioside in rats. Eisei Shikenjo Hokolu - Bulletin of National Institute of Hygienic Sciences 113, 31-35.

 

• Wasuntarawat C., P. Emcharoen, C. Toskulkao, P. Mungkornkarn, M. Suttajit and T. Glinsukon (1998): Developmental Toxicity of Steviol, a Metabolite of Stevioside, in the Hamster; Drug and Chemical Toxicology 21, 207-222.

 

• WHO Food Additives (1999) Series 42: Safety evaluation of certain food additives ”Stevioside”, Genf, 119-143.

 

• Wood D.J., Lirette A., Crober D.C. and Ju-Hy (1996) The effect of Stevia as a feed sweetener on weight gain and feed consumption of Broiler chickens. Can. J. Animal Sc. 76(2), 267-269.

 

·         Xili L., B. Chengjiany, X. Eryi, S. Reiming, W. Yuengming, S. Haodong and H. Zhiyian (1992): Chronic oral Toxicity and Carcinogenicity Study of Stevioside in Rats. Fd Chem. Toxic. 30(11), 957-965.

 

• Yamada A., Ohgaki S., Noda T. and Shimizu M. (1985) Chronic toxicity of dietary Stevia Extracts. J. of the Food Hygienic Society of Japan 26(2), 169-183.

 

• Yodyingyuad V. and S. Bunyawong (1991) Effect of stevioside on growth and reproduction. Human Reproduction, 6 (1), 158-165.